北京大学教授黄岩谊：新冠病毒实验室如何进行检测研究?(4)

疾病的特点导致了病毒侵染部位有特点，既有偏好，也受发病时间的影响。实际上，作为检测，可以用各种样品，不仅仅只是两种拭子。第七版的诊疗方案中明确提出了鼻咽拭子、痰、其他下呼吸道分泌物、血液、粪便的标本中都可以测出病毒核酸。还有调查研究表明，这么多的论文总结起来，看上去在很多样品中比如眼泪、粪便中都可能检测到核酸病毒，但这里面痰液或下呼吸道分泌物是最不容易漏检的，也就是检出率是最高的，接下来就是鼻咽拭子。所以可以发现真正做高质量的测量研究中，对样品的来源非常考究，要求一定要保证样品采样的质量，只有拿到好的样品才可能得到好结果。世界卫生组织在1月份就有指导文件，对不同样品的采集、保存、用途都做了很好的梳理，有了这样的指南，世界各地的科研人员和医务人员都可以遵循相对正规可靠的流程，来保证结果的可靠性。

样品采集后做检测，第一步通常是核酸提取，就是把样品中的核酸部分留下，其他部分杂质、人脱落的细胞、其他分子如蛋白质分子等等都除掉。通常的核酸提取，采用的都是把核酸分子用和它亲和力强的材料，例如硅胶等，先吸附；等到把其它物质都分离掉后，在把吸附的核酸分子洗脱下来，实现了提取，同时也是纯化和富集的步骤。这里可以采用的，在实验室里面，有两个方法。这两个方法现在在新冠病毒的核酸检测中，都广泛使用。要么使用硅胶膜来吸附，要么利用表面修饰的磁性小颗粒来实现吸附。这个步骤看上去很简单，但是这里最关键的一点，是要考虑到生物安全。有兴趣的观众，可以看中国医学科学院北京协和医院的培训教学视频，这个视频完整的演示了怎么做核酸提取，也强调了操作人员的生物安全问题。为了保证这一点，特别指出所有样品在操作前要先置于56度的水浴箱里进行30分钟灭活，使病毒失去感染能力。国家卫健委发布的《新型冠状病毒实验室生物安全指南》也说，未经培养的感染性材料的操作需要这么做，应当保持在生物安全二级标准的实验室进行，同时采用生物安全三级实验室的个人防护。

上图美国CDC的卡通图。生物安全三级，简单说是在封闭空间在采用负压，所有的空气跟其他物质不会没有经过处理直接外排到外界，这样一个生物实验环境。里面的人员和我们常在电视里看到的全副武装的白衣战士差别不大，都是一样的装束，只会更加严格，需要完全没有暴露的身体部位。生物二级要求没有那么严格，空气和外界有交换，有时在个别区域可以增加生物安全等级，做要求更高的实验。这次吴晨老师带领的武汉的方舱检测国家队，就是在一个移动的生物安全三级实验室工作的。

上图是吴晨教授在武汉现场工作的照片。左边的工作环境是生物安全二级，右边那个车是移动的生物安全三级的实验室，吴晨老师的打扮是标准的生物安全三级的打扮，如果不是有名字写在那里，其实你并不知道她是谁。全副武装做实验，是出于生物安全的考虑。

核酸提取之后是扩增的步骤，这是通过厂家提供的几管试剂实现的。上图中左边是华大基因的试剂，里面是几个小试管，右边是美国疾控中心分发的试剂，里面也是几个小试管。检测的过程叫做RT-PCR，就是逆转录-聚合酶链式反应。这是一个利用自然中存在的核酸复制机制来实现DNA分子的体外复制的操作，已经发明了近四十年，是分子诊断的基础技术，也是现代生物学和医学进步的重要奠基性技术。在每一个试管中，除了加待测样品就是核酸提取液外，还要加DNA聚合酶，逆转录酶，以及引物和探针。新冠病毒是RNA病毒，病毒里面包裹这一条基因组RNA，通过逆转录酶把这条RNA变成和它互补的DNA，然后再复制一遍，变成双链DNA，再往后就可以通过热循环一遍一遍的解开配对的双链，分别复制。1变2、2变4、4变8，经过N轮循环，理论上可以得到几何级数增长的特定片断的DNA。在复制的过程中，一个巧妙设计使每一次的复制能产生特定的荧光分子，复制的分子越多产生的荧光越多，我们就可以检测到这信号，这样一轮一轮的复制下去，我们看荧光增长。如果有荧光增长就是有待测物质，即所谓阳性；没有增长就是没有待测物质即所谓的阴性。荧光增长越快，就说明分子越多，增长越慢，说明分子越少，大概就这样一个过程。

这个过程历时不太长时间，能够给出这样一个图来（如上图），划一条线切过去，与荧光强度曲线交叉得到的值如果是低的证明你可能是阳性，这个值太高了或者没有出现（上升）证明是阴性。

这个判断在实际上还是有讲究的，做的过程中一定要加质控品，阴性质控和阳性质控都要有。一般来说阴性的就是纯净的水，里面不应该有待测的核酸，不应该出信号；如果出了信号，这次实验的可靠性就有问题。阳性的，一般是一个低浓度的样品，如果我们没有测出信号，证明这次实验不够灵敏，也许哪里有问题了，需要检查和重做。

另外，选择探针序列也就是引物序列非常讲究，在大概3万个碱基左右长度的序列，检测哪一段还是需要下一番功夫的。一组韩国科学家，前不久发表了一个对比结果，把一月份就分别采用的核酸检测的检测位点，的有效性做了一个相对客观的比较。各国科学家确定的用来做诊断的位点，是有区别的。上面这里，我标出了这些检测的核酸片段在基因组中的位置，比如中国的两个位点，一个是ORF1ab，另一个是N；而美国的三个，都在N蛋白基因上；德国的，一个在RdRp基因上，一个在E基因上。

（编辑：ASP站长网）