北京大学教授黄岩谊：新冠病毒实验室如何进行检测研究?(5)

上图是N基因的一段序列，里面用颜色表示的是，各个国家检测的位点，所使用引物的位置。可以看出，少量位置，各个国家的科学家们确定的有一些小的重叠，但是总的来说，并不是精确在一起。结果很有意思，韩国科学家的对比实验提出来中国和美国选择的位点是这些检测中灵敏度最高的，这也从侧面反映了我们科学家早期选择位点的时候选的很准，这是需要经验的，需要能力，也需要做出科学判断的。

核酸检测是否还可以改进？首先看速度，一个标准的核酸检测过程，取样是很快的，然后把它存到运送培养基里，把样品攒到一定数量的时候，集中灭活，56度、30分钟，然后进行核酸提取；核酸提取差不多30-90分钟，PCR反应40-60分钟，这个是可以一批样品，常常96个一起做的，出来之后可以快速结果判定，整个实验做下来大概小半天的样子。这个过程能不能加速？如果是单个样品，样品采集之后直接就做，可以跳过很多步骤，比如直接放到裂解液里面，然后做快速的核酸提取，甚至不做提取就做快速的PCR，这样可能在30分钟左右就拿到结果。可以看到，PCR检测本身是可以做到快速的，尤其是样品量少的时候可以这么做，但样品多的时候最好是一批一批地操作更有效率。

我后面还会讲到一些检测方法，我们先看一下前几天美国科学家的一个综述，把最近报道的各种核酸检测方法做了一个总结。

上图可以看到，各种方法检测所需的时间，大部分在一两个小时内都能做完，价格从几美元到十几美元。这里方法很多，有的已经不再是所谓RT-PCR方法，但还是充分借用了大自然的力量，利用自然界遗传物质的复制机制，进行特定的DNA片段的扩增，最终达到足够强的信号获取。扩增反应本身可以通过各种巧妙的方法加以实现。除了RT-PCR这一被反复验证和优化了20多年，被证明为极为可靠的临床检验方法之外，还有很多其他扩增方法被发明出来，面对新冠病毒的检测这些方法正在经受严格的考验。基于对检测速度的追求，即使是通过RT-PCR方法，为了减少操作上的技术壁垒和失误，可以采用所谓POCT的设备，也就是可以在现场使用的小型仪器装置。

上图中的两个是3月下旬的时候美国药监局最早批准紧急使用的两个仪器，分别可以在30分钟或45分钟内完成从样品到结果的检测全流程。在传染病流行期间利用这样的设备至少有两个重要好处，一个是分散处理病人检测需求，避免样品积压和运送困难。二是可以采用几乎全封闭的实验室设计，减少了操作者的生物安全风险。

上图的仪器可能是这一类检测仪器中最出风头的，这是美国超级销售特朗普亲自带货的小仪器，很可惜他没有摆对，图中不是正确的摆放方法。这个机器可以在5分钟之内给出阳性结果，十几分钟给出阴性结果，真正使用的时候整体所花的时间实际上会再长一些。要说明的是，这不是一个新的发明，不是有了新冠病毒突然就冒出了这么一个新发明。这个仪器已经在市面上很长时间了，在被新东家雅培买走之前，它已经是市场上用来检测流感病毒微生物的便携设备。

比如上图，这篇2014年深圳福田医院的科研人员参与的一篇论文，就是在评价这个仪器检测流感的表现。这个仪器用的基本技术是一个相对冷门的扩增方法，叫做NEAR（切口酶扩增反应），自然界存在很多奇奇怪怪的酶，可以做很多事情。切口酶就是在DNA切面上形成一个小切口，然后让聚合酶找到那个地方，可以开始做复制，不断的形成切口，不断的复制。这是非常巧妙的一个方法，不需要做PCR反应和热循环，属于等温扩增的一种。等温扩增的意思，是不需要做热循环，扩增过程在一个恒定的温度下进行，好处是这个过程变得非常简单；另一个好处是快，因为等温扩增的检测常常都是几分钟、十几分钟的时间尺度下完成的。除了NEAR之外，还有很多等温扩增反应可以利用在核酸的检测上。例如一个相对比较有名的LAMP环介导等温扩增，这是日本科学家Notomi等人在2000年左右发明的，这个方法也是用四个或者六个引物序列加到待测物质里面，把它的温度稍微升一点，通常会在60度左右的温度下做等温扩增反应，不需要很复杂的仪器很快就能做完。这个方法的一个好处是，设备可以做的很简单，可以很容易操作，肉眼就可以做判别。中国药监局也批准了基于这类反应的体外诊断试剂，例如这是成都博奥晶芯做的基于LAMP扩增方式的新冠病毒诊断设备。

还有其他方法，其中一个方法是RPA，也是相对比较容易。它用两种酶的组合，重组酶和聚合酶放在一起，通过一个很复杂的循环，实现核酸分子的扩增，虽然复杂但是非常高效，非常快。基于RPA，在美国波士顿有名的华裔青年科学家张锋，把它和基因编辑结合在一起，嫁接起来实现了对RNA的检测，他们起了一个名字叫SHERLOCK（福尔摩斯的大名）还用这个名字注册了企业，来做这个试剂的开发。无独有偶，在美国加州旧金山，基于LAMP方法，嫁接基因编辑，Jennifer Donna跟她的合作者一起也做了一个新方法，叫做DETECTR，成立的公司叫做Mammoth Biosciences。这两个方法比较上看，它们大概都可以实现30分钟到50分钟的检测，相对都是快的。这两个方法可以用试纸条的形式来读取结果，也很容易被大家所领会，不需要复杂仪器。

除了缩短时间，对于大规模的检测，提高检测通量是非常重要的，试剂盒可以拿来一盒就可以做好多检测，但是样品要一个一个测。还有核酸提取这样原来特别消耗体力而且需要经验、技巧、训练的工作，最好交给不知疲倦、不容易犯错的机器来操作。所以我们看到核酸提取自动化仪器大量出现在检测现场，这样的仪器遍布在各个定点医院，各级的疾控中心。

（编辑：ASP站长网）